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유전자 변형 마우스를 이용한 골질환 연구

최제용(경북의대 생화학-세포생물학교실)

  수정란에서 간엽줄기 세포가 된 후 연골세포, 조골세포 및 파골세포로 구성된 뼈 조직 세포들을 만드는 데까지 각 각 Sox9, Runx2, 그리고 RANKL 등의 핵심유전자가 필요하다. 특히 Runx2는 조골세포 형성 뿐 아니라 연골세포 성숙에도 중요한 역할을 담당하고 뼈 형성과정의 두 방식인 연골내막골화와 막내골화 모두 필요하여 뼈 형성 마스터 유전자로 알려져 있다. 뼈 조직 세포들 중 조골세포와 성숙된 비대연골세포는 몸을 구성하고 있는 세포들 중 혈중 칼슘과 인을 흡수하여 치아를 제외하면 단단한 뼈로 만들 수 있는 유일한 광화(biomineralization) 가능한 세포들이다. 평소 ‘유전자는 pathway이고 pathway는 진화 과정에 잘 보존되어 있다.’ 라고 학생들에게 말하면서 Runx2를 중심으로 연구실에서 수행하고 있는 대표적 노화 질환인 골다공증과 골관절염에 연관된 연구를 소개하고자 합니다.
골 형성과 Runx2의 기능과 주요 파트너 단백질들
  Runx 전사인자는 같은 DNA서열에 결합하는 독립적인 유전자인 Runx1, Runx2, Runx3가 존재하고 Runx 분리 과정부터 함께 검출된 Cbfβ가 파트너로 존재한다 (그림 1). Runx2가 조골세포 형성에 핵심역할을 한다는 사실이 밝혀진 후 많은 연구실에서 Runx2를 중심으로 발현과 pathway를 연구해 왔다. 특히 Runx2와 결합하는 단백질들을 밝혀 각종 pathway에서 기능을 규명하고 조골세포 형성과 연골세포 성숙에 어떻게 영향을 미치는지 다양하게 연구 되었다 (그림 2). 본 연구실에서도 Runx2의 발현을 좀 더 자세히 알아보기 위하여 transgenic 및 Runx2 knock-in 생쥐를 이용하여 조사한 바 Runx2는 뼈 뿐 아니라 생식기(정소의 정자, 난소의 황체) 및 뇌 등 다양한 조직에서 발현되어 뼈 조직 뿐 아니라 연조직 일부에도 중요한 역할이 있음을 시사하였다 (1).

[그림 1]. Runx 유전자들. DNA 에 결합하는 α-subunit은 Runx1 (혈액줄기세포 형성),
Runx2 (뼈 형성), Runx3 (신경 및 장관 발생과 암억제)로 구성되어 있고 파트너 단백질로 CBFβ가 있다.
Runx2와 Cbfβ
   살펴본 결과 Cbfβ가 반드시 있어야 되고 또 함께 작용함을 규명하였다 (2-3). 현재까지 Cbfβ는 Runx family를 배제하고 단독으로 기능이 잘 밝혀진 예는 아직 없다. Cbfβ는 Runx family 전사인자들과 모두 결합할 수 있고 여러 조직에 흔하게 발현되고 있는 상태라 Cbfβ를 조직 특이적으로 제거하면 Runx family들을 한꺼번에 제거할 수 있다. 따라서 어떤 Runx가 주된 역할을 하는지 찾아내는데 용이하여, 현재 뼈 조직 외에 근육이나 기타 연조직에서도 Cbfβ를 제거한 후 어떤 Runx 파트너와 주된 기능을 하는지 규명하고 있다. 특히 관절연골세포 특이적으로 Cbfβ를 제거한 경우 골관절염 유발 조건에서 어떤 영향을 미치는지 조사 중이다.

[그림 2]. Runx2의 각 도메인과 결합하는 파트너들 (붉은색: 연구실에서 수행).
Runx2 카복시 말단 부위는 여러 pathway들의 단백질들이 결합하는 정보 집적 부위.
Runx2와 VDR
   장에서 칼슘을 흡수하여 뼈의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하는 비타민 D는 VDR를 통하여 작용하고 또 VDR은 Runx2 파트너 단백질 중 하나로 역사적으로 osteocalcin 유전자 발현을 증가시킨다고 잘 알려져 있다. 최근 조골세포에 특이적인 VDR의 조건부 결손 쥐를 이용한 연구에서는 비타민 D가 조골세포에 작용하여 파골세포 분화 조절에 중요한 RANKL/OPG의 발현 비율을 저하시킴으로써 골흡수를 감소시킨다고 보고하였다 (4). 따라서 비타민 D가 조골세포를 직접적으로 조절하여 파골세포에 영향을 미치는 것으로 추정되지만, 이 제안을 뒷받침할만한 작용기전에 대한 분명한 증거는 밝히지 못하였다.
본 연구실에서는 파골세포 계열의 세포에서 비타민 D 수용체가 발현되며 파골세포 분화동안 그 발현이 감소함을 확인하였고, in vitro에서 비타민 D가 파골세포의 형성을 저해함도 확인하였다. 이를 근거로 비타민 D가 파골세포에 존재하는 비타민 D 수용체를 통하여 파골세포의 기능을 직접적으로 조절할 것이라는 가설 하에, LysM-Cre와 Cathepsin K-Cre 쥐를 이용하여 파골세포에 특이적인 VDR의 조건부 결손 쥐를 생산하였다. 현재 이들 쥐를 이용한 연구를 수행중이며, 이러한 연구를 통해 비타민 D의 골대사에 대한 명확한 역할 및 작용기전을 밝힐 수 있으리라 기대해 본다.

또한 고농도 비타민 D를 생쥐에 투여하면 혈관석회화가 일어나는 모델을 만든 후 VDR 결손 쥐와 Runx2 heterozygote에서 혈관석회화에 어떤 영향을 주는지도 알아보았다. 혈관평활근 세포는 비타민 D를 주면 VDR이 증가하고 증가된 VDR은 Runx2와 결합하여 뼈모세포 쪽으로 분화됨을 규명하였고 VDR 결손 쥐나 Runx2+/- 쥐는 혈관 석회화가 진행되지 않아 VDR와 Runx2가 병리적인 혈관석회화 과정에서도 중요함을 규명하였다 (5). 즉, Runx2는 뼈조직에서 조골세포 형성이나 비대연골세포로의 성숙 뿐 아니라 병적인 혈관석회화 과정에서 혈관평활근 세포의 조골양 세포로의 전환분화에도 중요함을 규명하였다. 여러 가지 염증성 사이토카인은 혈관평활근 세포를 조골양 세포로 분화를 촉진하는 반면 조골세포의 분화는 억제하여 반대로 작용하는 경향이 있다. 이 경우 Runx2가 어떻게 작용하는지 알아보는 것은 매우 흥미로운 과제로 생각된다.
Runx2와 ERα
  뼈 항상성 유지에 가장 중요한 분자 중 하나인 에스트로겐은 안드로겐을 아로마타제 (CYP19A1)가 작용하여 만들고 남녀 모두 에스트로겐이 부족하면 골다공증이 생긴다고 알려져 있다. 아로마타제는 뼈, 근육, 뇌, 지방 등 여러 국소 조직에서 발현되므로 상황에 맞게 에스트로겐을 만들 수 있다. Runx2가 과발현되면 아로마타제 발현과 에스트로겐 합성이 증가된다. 증가된 에스트로겐은 그 수용체인 ERα와 결합하여 Runx2 활성을 억제한다. 즉, 뼈조직에서 아로마타제는 Runx2의 하부 유전자이며 Runx2와 에스트로겐 pathway가 ERα를 통하여 음성되먹임 조절이 일어남을 알 수 있었다 (6). 뼈의 건강에 에스트로겐 또는 테스토스테론 같은 성호르몬의 중요한 역할을 고려하면 생식기에서도 발현되는 Runx2가 실제 뼈에 미치는 영향은 직간접적일 수 있음을 시사한다. Runx/Cbfβ complex와 ERα/Androgen receptor를 통하여 뼈와 그 외 조직간 상호작용을 알아보고 이것이 뼈의 항상성과 어떤 연관성이 있는지 규명하는 것은 흥미로운 연구 주제이다.
Runx2와 DICAM
  연구실에서 연골세포에서 발현되는 유전자들을 cDNA 라이브러리를 구축하고 EST 시퀀싱해서 데이터베이스를 만든 적이 있다 (7). 이 데이터에서 몇 가지 유전자들을 연구한 것 중 Runx2의 하부 유전자이면서 세포 부착과 연관된 것으로 DICAM(Dual immunoglobulin domain containing cell adhesion molecule) 유전자가 있다. DICAM은 다양한 조직에서 발현되며 세포간 부착을 잘 시키는 단백질로 integrin αVβ3를 통하여 파골세포 분화를 억제하는 것으로 조사되었다 (8). 최근 DICAM이 심한 관절통을 초래하는 치쿤구니아 바이러스의 수용체(9)로 알려지면서 더욱 연구가 진행되고 있는데 본 연구실에서도 파골세포에서 이 단백질의 기능을 in vivo 모델로 연구하고 있다.
마치면서
  연구실에서 수행한 내용들은 주로 Runx2/Cbfβ를 중심으로 이루어졌고 뼈와 연조직에서 그 기능을 연구하면 뼈 조직에 미치는 영향을 더 종합적으로 잘 알 수 있을 것이다 (그림 3). 연구실에서 경험한 흥미로운 발견들은 국내외 훌륭한 연구팀과 공동 연구를 수행하면서 이룬 경우가 많다. 앞으로도 좋은 연구를 위한 공동 연구는 지속되길 바라며 학생들에게 또 다른 요구를 한다. ‘과학은 토론으로 이루어지며, 나의 보물(treasure)이 남에게 쓰레기(trash)가 될 수도 있고, 또 나의 쓰레기가 남에게 보물이 될 수 있다.’ 라고 서로 대화(dialog)를 많이 하도록 요구하면서 함께 노력하고 있다.

[그림 3]. Runx2/Cbfβ complex는 뼈 조직 뿐 아니라 여러 연조직에서도 발현되며
각 조직/장기별 긴밀한 대화를 통하여 새로운 기능을 시사
참고문헌

1. Jeong JH, Jin JS, Kim HN, Kang SM, Liu JC, Lengner CJ, Otto F, Mundlos S, Stein JL, van Wijnen AJ, Lian JB, Stein GS, Choi JY. Expression of Runx2 transcription factor in non-skeletal tissues, sperm and brain. J Cell Physiol. 217:511-7, 2008.

2. Lim KE, Park NR, Che X, Han MS, Jeong JH, Kim SY, Park CY, Akiyama H, Kim JE, Ryoo HM, Stein JL, Lian JB, Stein GS, Choi JY. Core binding factor β of osteoblasts maintains cortical bone mass via stabilization of Runx2 in mice. J Bone Miner Res. 30:715-22, 2015.

3. Park NR, Lim KE, Han MS, Che X, Park CY, Kim JE, Taniuchi I, Bae SC, Choi JY. Core Binding Factor β Plays a Critical Role During Chondrocyte Differentiation. J Cell Physiol 231:162-71, 2016.

4. Nakamichi Y, Udagawa N, Horibe K, Mizoguchi T, Yamamoto Y, Nakamura T, Hosoya A, Kato S, Suda T, Takahashi N. VDR in osteoblast-lineage cells primarily mediates vitamin D treatment-induced increase in bone mass by suppressing bone resorption. J Bone Miner Res. 32(6):1297-130, 2017.

5. Han MS, Che X, Cho GH, Park HR, Lim KE, Park NR, Jin JS, Jung YK, Jeong JH, Lee IK, Kato S, Choi JY. Functional Cooperation between Vitamin D Receptor and Runx2 in Vitamin D-Induced Vascular Calcification. PLoS One. 8:e83584, 2013.

6. Jeong JH, Jung YK, Kim HJ, Jin JS, Kim HN, Kang SM, Kim SY, van Wijnen AJ, Stein JL, Lian JB, Stein GS, Kato S, Choi JY. The gene for aromatase, a rate-limiting enzyme for local estrogen biosynthesis, is a downstream target gene of RUnx2 in skeletal tissues. Mol Cell Biol., 30:2365-75, 2010.

7. Jung YK, Jeong JH, Ryoo HM, Kim HN, Kim YJ, Park EK, Si HJ, Kim SY, Takigawa M, Lee BH, Park RW, Kim IS, Choi JY. Gene expression profile of human chondrocyte HCS-2/8 cell line by EST sequencing analysis. Gene 330:85-92, 2004.

8. Jung YK, Han SW, Kim GW, Jeong JH, Kim HJ, Choi JY. DICAM inhibits osteoclast differentiation through attenuation of the integrin αVβ3 pathway. J Bone Miner Res. Sep;27(9):2024-34, 2012.

9. Zhang R, Kim AS, Fox JM, Nair S, Basore K, Klimstra WB, Rimkunas R, Fong RH, Lin H, Poddar S, Crowe JE Jr, Doranz BJ, Fremont DH, Diamond MS. Mxra8 is a receptor for multiple arthritogenic alphaviruses. Nature 557:570-74, 2018.

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